一、抗体剪裁;一、抗体剪裁;1、抗体的人源化
新的挑战：
改造鼠源McAb基因，综合人—鼠嵌合McAb的优点；
获得特异性高、异源性小的，具有临床应用价值的抗体。
为何要人源化？
相对于“人”杂交瘤细胞系统，“鼠”杂交瘤细胞生长快，产生抗体量大。
鼠McAb用于人体，免疫原性和相对缺乏恒定区依赖的功能效应，使它的应用受到了一定的限制。
改造的必要性：
对鼠源McAb进行蛋白质工程改造，合成人源化单抗。;（1）鼠单克隆抗体恒定区的人源化
将小鼠McAb恒定区用人抗体恒定区代替而拼接成嵌合抗体，既具有抗原结合特异性，又极大地降低了鼠单克隆抗体的异源性。
改造策略和程序：
①克隆鼠McAb可变区基因——从鼠杂交瘤
提取mRNA→可变区基因cDNA文库→表达载体→抗原特异性筛选→可变区基因；
②选择合适的人恒定区基因；
恒定区基因比较保守，易于克隆获得
③重组载体的构建与表达
抗体分子的糖基化和可变区的折叠、链内二硫键形成，
以及重链和轻链相互作用形成正确的立体构象。
常用哺乳类细胞表达系统;CH3
;（2）人改型抗体（互补决定区移植）
问题提出：
人源化嵌合抗体的可变区仍具有抗原性。能诱发人产生抗小鼠抗体，导致过敏反应，需对人源化抗体的可变区再进行改造。
抗体可变区组成：
互补决定区（CDR）和骨架区组成。CDR：识别抗原表位的区域，直接决定了抗体的特异性；骨架区——维持CDR构象
骨架区序列及其立体结构较为保守，是嵌合抗体诱导人抗小鼠抗体的主要原因；
将鼠McAbCDR移植到人McAb的可变区的骨架上，使人McAb获得鼠McAb结合特异性，进一步减少异源性。
互补决定区移植的设计
简单地将CDR序列移植到人源抗体中，甚至完全丧失亲和力。
必须进行互补决定区序列与框架结构的移植设计。;移植设计的原则
将CDR序列和紧邻两侧的骨架序列一起移植；
对骨架区中影响抗原结合部位的aa残基改为鼠源McAb的残基；
人McAb可变区序列的选择：抗体可变区序列数据库分析，选择与鼠单克隆抗体同源性高的人源序列；
保留可变区N末端aa序列，尤其是轻链可变区N末端序列。
将人改型可变区基因与人lg恒定区基因连???，构成完整的人改型基因进行表达。;2、抗体的小分子化改造
小分子抗体？能与抗原结合的抗体小分子V区片段——称~，具识别活性
主要包括4类
Fab抗体：酶水解法：用木瓜水解酶消化抗体可获得2个Fab片段。2条肽链
基因工程方法：在Fab基因表达Fab片段的功能。H链和L链基因分别构建，在2个载体上，共转染细胞，或者构建在一个载体上转染细胞进行表达。
Fv抗体：Fv是由轻链和重链可变区组成的单价小分子，是与抗原结合的最小功能片段。2条肽链
分别构建含H和L可变区基因的载体，共转染细胞，使之各自表达后组装成功能性Fv分子；或在一个载体中H可变区和L可变区基因之间设置终止密码子，分别表达2个小分子片段。
单链抗体（ScFv）：将轻链和重链的可变区连接起来的抗体。1条肽链
单价抗体的特点：
优点：分子量小，免疫原性弱、渗透力强，并可用于药物导向、中和毒素等功能。
缺点：无抗体C区，不能介导抗体的其他生物学效应。
双价抗体片段：利用单价抗体片段构建双价单特异性抗体和双价多特异性抗体。;3、双特异性抗体（完整抗体）
双特异性抗体(BsAb)？也称双功能抗体或杂交抗体，为非天然抗体。
2个抗原结合部位，具有不同的特异性
化学结构上是双价的，结合抗原的功能上是单价的；
不同于天然抗体（在化学结构及功能上均是双价的）
BsAb具有双特异性，能交联2种抗原，可介导标记物与靶抗原结合（造影）。
双特异性抗体制备方法
化学交联双特异性抗体：制备单价抗体，双功能交联剂交联。
细胞工程双特异性抗体：通过细胞融合的方法制备双特异性抗体。可将分泌单抗的杂交瘤与经免疫的脾细胞融合，或使两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤彼此融合。
基因工程双特异性抗体：体外组装表达分泌型的双特异性抗体。;4、基因工程抗体基因的表达
概述：
蛋白质的表达系统有很多，其中主要包括大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物类细胞、昆虫细胞及植物细胞等表达系统。
抗体分子表达：常用大肠杆菌和哺乳类细胞。
大肠杆菌：原核细胞表达系统。
成熟的基因克隆、蛋白表达体系，具有繁殖迅速、易于操作控制等优点。
缺乏蛋白质加工系统，内源性蛋白酶易降解外源蛋白，内毒素导致人体热源反应
仅可用于表达抗体片段，如单链抗体等。
难以表达完成的抗体
哺乳类细胞：真核细胞表达体系，
可完成正确的蛋白质修饰和装配，更接近天然抗体，具有正常的生物活性；
缺点是成本高，操作相对烦琐。;二、蛋白质关键残基嫁接;1987年开始从事化学与生物学的交叉研究，
特别是生物信息学研究，在蛋白质结构预测及分子