（五）热处理法如：将培养好的含葡萄糖异构酶的链霉菌在60~65℃温度下处理15min，可以使葡萄糖异构酶固定在菌体内。将含酶细胞在一定温度下热处理一段时间，使酶固定在菌体内。只适用于热稳定性较好的酶的固定化。第30页，共56页，星期日，2025年，2月5日四、固定化酶的活力测定方法介绍1.振荡测定法：2.酶柱测定法：第31页，共56页，星期日，2025年，2月5日评价固定化酶的指标：或称偶联效率，活力保留百分数。相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力第32页，共56页，星期日，2025年，2月5日方法优点缺点吸附法制作条件温和、简便、成本低、载体再生、可反复使用结合力弱，对pH、离子强度、温度等因素敏感，酶易脱落，酶的装载容量较小共价法载体与偶联方法可选择性大；酶的结合力强，非常稳定偶联条件激烈，易引起酶失活；成本高，某些偶联试剂有一定毒性交联法可用的交联试剂多，技术简易，酶的结合力强，稳定性高交联条件激烈，机械性能差包埋法包埋材料、包埋方法可选余地大，固定化酶的使用面广，包埋条件温和仅可用于低分子量的底物，不适用于柱系统，常有扩散限制问题各种酶固定化方法的比较第33页，共56页，星期日，2025年，2月5日影响固定化酶（细胞）性质的因素酶经过固定化后引起的性质改变，不外乎两种原因：一是酶本身的变化，二是受固定化载体的物理或化学性质的影响。就载体物化性质和固定化过程影响而言，主要存在以下三种影响效应：.?分配效应?空间障碍效应?扩散限制效应固定化后的特征第34页，共56页，星期日，2025年，2月5日1、分配效应由于载体和底物的性质差异引起了微环境和宏观环境之间的性质不同。微环境是在固定化酶附近的局部环境，而将主体溶液称为宏观环境。由这种不同造成的底物、产物和各种效应物在两个环境之间的不同分配，被称为分配效应。第35页，共56页，星期日，2025年，2月5日2、空间障碍效应固定化之后，由于酶的空间自由度受到限制(因为载体的空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶的活性部位造成了空间屏障)，使酶分子的活性基团不易于底物或效应物接触，影响酶分子的分子活性中心对底物的定位作用,所造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称为空间障碍效应。第36页，共56页，星期日，2025年，2月5日第37页，共56页，星期日，2025年，2月5日3、扩散限制效应酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产生了扩散阻力：1）、外扩散阻力是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过程中的一种扩散限制效应，它发生在反应之前，发生在固定化颗粒周围的液膜层。它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。2）、内扩散阻力是指底物分子达到固相酶表面后传递到酶活性部位时的一种扩散阻力，它与催化反应同时进行。载体小而弯曲的细孔是产生内扩散阻力的要原因。因此使用低分子量底物，小的粒径、载体孔尽可能大而直且互相连通，或仅仅将酶固定在载体表面都可以降低这种内扩散阻力。第38页，共56页，星期日，2025年，2月5日1.固定化对酶稳定性的影响(1)固定化酶增加了酶的耐热性(2)固定化增加了酶对变性剂,抑制剂的抵抗能力(3)固定化减轻了蛋白酶的破坏作用(4)固定化可延长酶的操作和保存有效期五、固定化酶的特性第39页，共56页，星期日，2025年，2月5日可能原因：固定化后酶与载体多点连接，可以防止酶伸展变性；酶活力的缓慢释放；抑制酶的自降解，酶分子之间相互作用的机会大大降低。在工业上半衰期超过一个月有应用价值。第40页，共56页，星期日，2025年，2月5日第1页，共56页，星期日，2025年，2月5日主要内容为什么要固定化什么叫做固定化如何固定固定化的酶活力测量固定化酶的特征固定化酶的应用第2页，共56页，星期日，2025年，2月5日1、稳定性差2、回收困难，一次使用3、产物的分离纯化困难一、为什么要对酶进行固定化？第3页，共56页，星期日，2025年，2月5日二、什么是固定化酶固定化酶（Immobilizedenzyme）：固定在一定载体上，在一定空间范围内起催化作用的酶。水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术第4页，共56页