细胞存活率测定吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）染色法标准化研究报告
StandardizationResearchReportonCellViabilityDeterminationbyAcridineOrange/PropidiumIodide(AO/PI)StainingMethod
摘要
细胞存活率测定是生物医药、细胞治疗及基础科研中的核心检测环节，其结果的准确性与可靠性直接关系到产品质量与临床应用安全。随着细胞治疗技术的快速发展，对细胞存活率检测方法的标准化需求日益迫切。本研究基于吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）荧光染色法，系统分析了其技术原理、操作规范及适用范围，旨在通过标准化手段解决当前细胞存活率检测中存在的重复性差、结果可比性低等问题。报告详细阐述了AO/PI染色法的关键技术参数、实验条件优化及质量控制要求，并通过对标国际标准（如ISO20391-2:2019），提出了适用于我国生物医药行业的标准化方案。研究结果表明，AO/PI染色法具有高灵敏度、快速检测和低成本等优势，其标准化将显著提升细胞治疗产品的质量控制水平，为行业监管提供技术支撑。
关键词：细胞存活率；吖啶橙/碘化丙啶；荧光染色法；标准化；细胞治疗；质量控制
Keywords:CellViability;AcridineOrange/PropidiumIodide;FluorescenceStaining;Standardization;CellTherapy;QualityControl
正文
1.目的与意义
细胞存活率测定是细胞研究、生产与应用过程中的基础性检测活动，在生物医药、生物制造及生命科学基础研究中具有广泛应用。近年来，随着CAR-T、干细胞治疗等前沿技术的快速发展，细胞治疗产品的安全性与有效性成为行业关注焦点。细胞存活率作为细胞产品质量的核心指标之一，其检测结果的准确性与可比性直接影响到产品的临床疗效与安全性。
目前，国内外细胞存活率检测方法多样（如台盼蓝染色法、MTT法等），但存在操作流程不统一、结果判读主观性强等问题。AO/PI荧光染色法因其能够区分活细胞与死细胞的核染色特征，且具备快速、高灵敏度的技术优势，逐渐成为细胞治疗领域的主流检测方法。通过制定本标准，可明确AO/PI染色法的技术要求和操作规范，为细胞治疗产品提供统一的质量评价依据，推动行业技术协同与监管标准化。
2.范围与主要技术内容
本标准规定了通过吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）荧光染色法进行细胞存活率检测的技术要求，适用于所有有核细胞的存活率测定，包括但不限于免疫细胞、干细胞、肿瘤细胞系等。该方法通过双荧光标记实现对活细胞与死细胞的精准区分：
-吖啶橙（AO）：作为膜通透性染料，可进入所有细胞（活细胞与死细胞）的细胞核，与双链DNA结合后发射绿色荧光（最大发射波长530nm）。
-碘化丙啶（PI）：仅能通过受损的细胞膜进入死细胞，与DNA结合后发射红色荧光（最大发射波长617nm）。
当两种染料共存时，PI可通过荧光共振能量转移（FRET）淬灭AO的绿色荧光，使得活细胞仅显示绿色荧光，死细胞仅显示红色荧光，从而实现细胞存活率的定量分析。
本标准的主要技术内容包括：
1.术语与定义：明确“细胞存活率”“荧光淬灭”“双染色法”等核心概念。
2.试剂与耗材：规定AO/PI染料的纯度、浓度及保存条件，推荐使用无荧光背景的检测耗材。
3.仪器设备：要求荧光显微镜或流式细胞仪具备双通道检测能力（激发光波长：AO为502nm，PI为535nm）。
4.试验步骤：详细规范细胞制备、染料孵育时间（建议5-15分钟）、避光操作及荧光检测流程。
5.结果计算：提供细胞存活率计算公式（存活率=活细胞数/总细胞数×100%），并说明统计要求（至少计数3个重复样本）。
6.记录与报告：明确实验记录需包含细胞类型、染料批号、仪器参数及异常数据说明。
参与修订的企事业单位或标委会
中国食品药品检定研究院（NIFDC）
作为本标准的主要起草单位，中国食品药品检定研究院在细胞治疗产品质量控制领域具有权威地位。该机构长期致力于生物技术产品的标准化研究，牵头制定了多项细胞治疗相关技术指南与国家标准。在本标准的修订过程中，NIFDC联合多家细胞治疗企业、科研机构及临床单位，通过多中心实验验证了AO/PI染色法的重复性与可靠性，并参考国际标准（如USP〈1046〉）优化了技术细节，确保了标准的科学性与适用性。
结论与展望
AO/PI荧光染色法标准化方案的提出，填补了我国在细胞存活率检测领域的技术空白，为细胞治疗产品的质量评价提供了关键技术支撑。未来，随着单细胞测序、微流控技术的发展，细胞存活率检测方法将进一步向高通量、自动化方向演进。建议后