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人食管鳞癌类器官构建、鉴定与保藏指南
1范围
本文件描述了从来源于人食管鳞状上皮肿瘤组织提取肿瘤细胞构建类器官的原理、实验方法、传代、冻存以及复苏方法。
本文件适用于科研用食管鳞状上皮肿瘤组织类器官的培养、类器官传代、类器官鉴定、类器官冻存和复苏及相应实验操作。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T38736-2020人类生物样本保藏伦理要求
3术语和定义
GB/T38736-2020界定的以及下列术语和定义适用于本文件。
3.1
食管鳞癌类器官organoidsofesophagealsquamouscellcarcinoma
由食管鳞状上皮肿瘤组织分离的单细胞悬浮液或细胞聚集体接种到细胞外基底膜基质中发育的3D培养系统。在细胞成分、组织架构及功能上与患者肿瘤组织一致，可重现肿瘤的细胞异质性。
3.2
食管鳞癌类器官培养基culturemediumofgastrointestinalorganoids
可以实现体外模拟食管鳞癌肿瘤细胞生长所需微环境，能维持食管鳞癌肿瘤干细胞活性，并保留其分化能力的培养系统。
3.3
类器官培养基质胶matrigelmatrix
基质胶是层粘连蛋白、IV型胶原、硫酸肝素蛋白聚糖、巢蛋白和其他生长因子的组合，其来源于小鼠肉瘤。可以为类器官提供生长所需的三维空间结构。
3.4
传代passage
将培养状态良好的类器官采用酶解法使其解离为细胞团或单细胞悬液，再重新接种于与原培养条件相同的培养体系内,继续进行类器官培养，防止类器官过度生长死亡。新一代类器官与原来类器官具有相同的形态功能特征。
3.5
冻存cryopreservation
使暂时不需要进行实验研究的类器官脱离生长状态，但又可以保持其细胞组成、形态和功能特征的低温冷冻过程。
3.6
复苏thawing
将处于低温冻存的类器官取出恢复其继续生长状态的过程，复苏的类器官与冻存前状态一致。
3.7
类器官药物敏感性检测drugsensitivitytestingoforganoids
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将食管鳞癌类器官接种到不同梯度浓度化疗药物的多孔板（如96孔板）。随后，通过培养和检测ATP含量或AI图像分析，可以计算不同浓度对类器官的抑制率，以评估患者对该药物的敏感度。
3.8
半抑制浓度halfmaximalinhibitoryconcentration
指当给定药物对食管鳞癌的生物活性的抑制率达到50%时，给定药物所对应浓度。
3.9
知情同意informedconsent
供体对生物样本捐赠的目的和研究用途等明了和认可。以生物样本供方自愿同意参与为原则，以当事双方共同签署知情同意书为具体体现。
【来源：GB/T38736-2020；3.7】
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
PBS：磷酸盐缓溶液（Phosphatebuffersolution）
DPBS：杜氏磷酸盐缓冲液（DulbeccosPhosphate-BufferedSaline）
HBSS：汉克斯平衡盐溶液（HanksBalancedSaltSolution）
STI：大豆胰蛋白酶抑制剂（Soybeantrypsininhibitor）
ATP：腺嘌呤核苷三磷酸(AdenosineTriphosphate)
IC50：半抑制浓度（halfmaximalinhibitoryconcentration）
DNaseI：脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DeoxyribonueleaseⅠ)
Y-27632：选择性ROCK1和ROCK2抑制剂
HE：苏木精伊红染色（Hematoxylin-EosinStaining）
5通则
5.1食管鳞癌类器官采集与处理应获得伦理委员会审批。
5.2提供者必须明确被病理诊断为食管鳞状上皮癌。
5.3组织采集前应签署知情同意书，应在充分告知、尊重提供者权利的前提下签署知情同意书。
5.4组织的采集与处理不可对患者的诊断与治疗产生任何干扰。
5.5食管鳞癌类器官的组织采集与处理应由接受过专业培训的医护人员及工作人员进行。
6操作流程
6.1组织获取和类器官构建
6.1.1组织的获取
切除食管鳞癌肿瘤组织时，应避开坏死区域，且切下的组织块不小于6mm3。新鲜组织应在离体30min内切取，并至于含Y-27632的冰冷HBSS溶液。
6.1.2组织的清洗
切取