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文档摘要

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第五章基因组测序技术;优选第五章基因组测序技术;一些主要模式生物基因组测序概况;一、测序流程

1.构建生物基因组文库或cDNA文库

DNA的提取和制备→酶切制备克隆用DNA片段

→与载体连接→转化受体细胞

→筛选鉴定→扩增培养。

2.从基因组文库中提取DNA大片段，进行测序：

将DNA用超声波（或限制性内切酶）切成能够测序的小片断(200-500bp)→小片断和载体结合，植入细菌中进行扩增（或用PCR扩增）→从细菌中提取出繁殖好的质粒→酶切，制取测序的DNA片段

3.测序：上测序仪测序。

4.利用重叠技术，排出DNA大片段的序列。;二、DNA测序的方法

双脱氧链终止法测序

化学降解法测序

自动化测序

非常规DNA测序;（一）Sanger的双脱氧链末端终止法;Cambridge的F.Sanger在1977年发明用双脱氧链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如下：

①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；

②该酶能够用2‘，3’--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3‘-末端，从而终止其延伸反应。

在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一种ddNTP。常用Klenow大片段，无5→3外切酶活性。;2.技术路线与要求