OncomineLungCell-FreeTotalNucleicAcid
1
1.1
1.2
1.3
2
2.1
ResearchAssay验证分析
描述
OncomineLungcfTNA检测从全血血浆组分中分离的肺癌肿瘤来源无细胞DNA和RNA(无细胞总核酸；cfTNA)。其提供了文库构建试剂，以及用于从单管10mL全血的血浆组分中获得的cfTNA制备扩增子文库的多重PCR引物池。
优势
?侵入性较小，可在多个时间点采集样品以监测癌症进展
?成本较低
?从样品到结果的周转时间更短
?更好地表示肿瘤异质性
检测类型
?热点基因(SNV)和短插入缺失：ALK、BRAF、EGFR、ERBB2、KRAS、MAP2K1、MET、NRAS、PIK3CA、
ROS1和TP53(覆盖~168个热点)
?基因融合：ALK、RET、ROS1
?MET14外显子跳跃
?拷贝数基因(CNV)：MET
检测下限
20ngcfDNA起始量下：
?对于SNV/短插入缺失，可实现LOD为0.1%、灵敏度为~90%、特异性99%
?对于融合和MET外显子跳读，可实现LOD为1%、灵敏度为90%、特异性99%
?对于METCNV靶标，可实现检测低至1.2倍扩增、灵敏度为90%、特异性99%
分析方法
整个工作流程，从使用MagMAX无细胞总核酸分离试剂盒分离cfTNA到样品分析，可使用IonS5XL测序系统在两天内完成。
实验流程
PurifythetargetampliconsSizeselectthebarcodedlibrary
Purifythetarget
amplicons
Sizeselectthebarcodedlibrary
Oncomine
Oncomine?
LungCell?FreeTotalNucleicAcidResearchAssay
cell
cell?freetotal
nucleicacid
Reversetranscribe
cell-freetotal
nucleicacid
Amplifytargets
4
45μL(1.5×samplevolume)ofAgencourt?AMPure?XPReagent150μLof80%ethanol
24μLofLowTE
Amplifythetarget
ampliconswith
barcodedprimers
Purifythebarcoded
library
57.5μL(1.15×samplevolume)ofAgencourt?AMPure?XPReagent
150μLof80%ethanol
50μLofLowTE
50μL(1.0×samplevolume)ofAgencourt?AMPure?XPReagent150μLof80%ethanol
30μLofLowTE
Quantifythe
librarybyqPCR
3开发验证
3.1样本储存条件验证
3.1.1血液收集管验证
3.1.1.1验证方案
3.1.1.2验证结果
不同储存条件下的测序结果比较
3.1.1.3验证结论
在0.1％的LOD下，Streck管的假阳性率高于EDTA管。因此，建议使用K2EDTA血液采集管进行OncomineLungcfTNA研究分析。使用K2EDTA试管时样品应在采集后6小时内处理，以避免白细胞裂解。如果无法在采集后的6小时内进行血液处理，则白细胞稳定管(例如Streck管)可在处理时间上提供更大的灵
活性。
3.1.2血液在Streck管的储存时间验证
3.1.2.1验证方案
3.1.2.2验证结果
采集后不同时间处理后的测序结果比较
RNA质控基因分子计数
3.1.2.3验证结论
室温下保存一天后，热点位置存在更多的假阳性，提示更多的DNA损伤。为了最大程度地减少误报，