职业教育医学生物技术专业教学资源库实验DNA的琼脂糖凝胶电泳一、实验目的

职业教育医学生物技术专业教学资源库二、实验原理1.核酸分子是两性解离分子，pH3.5时碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。

职业教育医学生物技术专业教学资源库2.琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小，DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。-+

职业教育医学生物技术专业教学资源库3.琼脂糖是一种聚合链线性分子，含有不同浓度的琼脂糖凝胶构成的分子筛的网孔大小不同，可用于分离不同浓度范围的核酸分子。琼脂糖凝胶适合分离长度100bp至60Kb的分子，选择不同浓度的凝胶，可以分离不同大小范围的DNA分子。

职业教育医学生物技术专业教学资源库4.核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭(EB)。溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射EB-DNA复合物时，可以发出荧光。荧光强度跟DNA的浓度呈正比。

职业教育医学生物技术专业教学资源库三、实验试剂与仪器：1、仪器及耗材水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、微波炉、微量移液器、100mL或250mL锥形瓶、量筒、枪头等2、试剂(1)50XTAE缓冲液(2MTris-乙酸，0.05MEDTA)。(2)6X上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油(3)EB替代物、低熔点琼脂糖(4)DNA样品、DNAMarker

职业教育医学生物技术专业教学资源库溴酚兰在0.5%~1.4%的琼脂糖凝胶中的泳动速度大约相当于300bp的线性DNA的泳动速度，而二甲苯青FF的泳动速度相当于4Kb的双链线形DNA的泳动速度。

职业教育医学生物技术专业教学资源库四、实验步骤

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职业教育医学生物技术专业教学资源库1、按所分离的DNA分子的大小范围和样品数量，称取适量的琼脂糖粉末，放到一锥形瓶中，加入适量的1XTAE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。冷却至60°C左右，在胶液内加入适量的核酸染料（10μL/100ml）。2、取制胶板槽，胶槽四周封严，水平放置胶槽，在一端插好梳子，向槽内缓慢倒入已冷至60°C左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。3、待胶凝固后，将胶槽放到电泳槽内，使加样孔端置负极端，注入1XTAE电泳缓冲液至液面覆盖过胶面，小心拔出梳子。4、把待检测的样品，按以下量（1μI加样缓冲液(6×)+5μI待测DNA样品）在洁净载玻片上小心混匀，用移液枪加至凝胶的加样孔中，编好加样顺序。

职业教育医学生物技术专业教学资源库5、接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节稳压输出，电压最高不超过5V/cm，开始电泳。6、观察溴酚兰的带(蓝色)的移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处，可停止电泳。7、在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把凝胶放在上面。关上样品室外门，打开紫外灯(360nm或254nm)，通过观察孔进行观察。拍照保存。++--

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