1不连续凝胶电泳分成三层：样品胶、浓缩胶、分离胶。特别适用于稀溶液的分离。-+样品胶浓缩胶分离胶第31页，共48页，星期日，2025年，2月5日2、SDS-凝胶电泳制备凝胶时加入1~2%的十二烷基硫酸钠，制成SDS-凝胶。第32页，共48页，星期日，2025年，2月5日3.6.2等电聚焦电泳在电泳系统中加入两性电解质载体,通电后在电场中形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。待分离组分在电场作用下移动到与其等电点相当的pH位置上，使不同等电点的物质分离。第33页，共48页，星期日，2025年，2月5日特点分辨率高：可分开等电点相差0.01~0.02pH的蛋白质。克服了电泳的扩散作用：时间越长区带越窄。与点样位置关系不大：不论点在何处都可以聚焦到等电点位置。重现性好可分离很稀的样品可准确测定蛋白质或多肽的等电点。对等电点处不溶解或发生变性的蛋白质不适用第34页，共48页，星期日，2025年，2月5日关于酶的分离纯化(4)第1页，共48页，星期日，2025年，2月5日要点：酶主要还是蛋白质，能用于蛋白质的分离纯化方法通常可用于酶。要尽量减少酶活损失。要分清是胞内酶还是胞外酶根据酶的用途采用不同的方法第2页，共48页，星期日，2025年，2月5日3.1酶分离纯化流程酶原液否胞内酶细胞破碎提取分离浓缩干燥预处理细胞分离第3页，共48页，星期日，2025年，2月5日3.2酶纯度的评价总活力的回收率比活力提高的倍数酶的纯度实用价值＜－－侧重科研第4页，共48页，星期日，2025年，2月5日3.2.1酶总活力回收率与提纯倍数1总活力的回收率：反映提纯过程酶活力的损失情况。总活力的回收率＝纯化后总活力/纯化前总活力*100%2提纯倍数：反映纯化方法的效率纯化倍数＝纯化后的比活/纯化前的比活第5页，共48页，星期日，2025年，2月5日示例：腺苷酸激酶纯化表（6kg猪肉）纯化步骤总体积总蛋白总活力比活力纯化倍数回收率抽提16600435000.04130.951100ml mg katal katal/kg%调pH1570011200 3.25层析13801716 13.02凝胶过滤211462 43.17结晶- 344 46.5第6页，共48页，星期日，2025年，2月5日3.2.2酶的纯度检验注意标明使用何种方法检验的.不同方法检验的纯度可能不一致。如电泳纯、层析纯、HPLC纯。第7页，共48页，星期日，2025年，2月5日常用的检验酶纯度的方法方法 特点超速离心检测杂质＜5%时不太满意，不适合络合解离体系电泳必须在多种pH值下进行，单一pH两种酶可能一 起移动SDS－电泳可测出分子量，多亚基时会出现多条区带等电聚焦检测杂的极灵敏方法，有时会出现表观异质现象N－末端分析只适用于一条肽链免疫技术高度的专一性，但抗血清制备较为麻烦第8页，共48页，星期日，2025年，2月5日3.3分离与纯化分离（提取）：在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中。纯化：通常先根据溶解度性质用沉淀的方法（如盐析、有机溶剂沉淀等），制得粗酶，再根据酶分子的大小、电荷性质、亲和专一性，将酶纯化。第9页，共48页，星期日，2025年，2月5日3.3.1细胞破碎的方法机械破碎法物理破碎法化学破碎法酶促破碎法P72-73第10页，共48页，星期日，2025年，2月5日3.3.2酶提取的方法盐溶液提取法酸溶液提取法碱溶液提取法有机溶剂提取法p76根据酶的溶解性质，选择适当的溶剂。第11页，共48页，星期日，2025年，2月5日3.3.3影响酶提取的主要因素1提取目标:提高提取率减少酶活损失。1)温度：温度过高易导至酶失活，应控制在0－10℃，对于稳定性高的酶提高温度有利于提取。2）pH:pH应远离等电点以提高溶解度，但pH不宜过高或过低，防止酶失活。3)提取液用量：用量增加，提取率增加但分离成本提高。一般为原液的3-5倍4)添加保护剂：加入适量的酶作用底物、辅酶或抗氧化剂可以提高酶稳定性，