关于高效液相色谱-串联质谱法测定牛肉中β-激动剂类药物残留的研究
1实验部分
1.1实验材料与设备
1.1.1实验材料
牛肉：经检验β-受体激动剂呈现阴性的牛肉，绞碎均质。
1.1.2主要试剂
甲醇、乙腈、甲酸、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、高氯酸、氨水、氢氧化钠溶液、乙酸铵缓冲液、甲酸水溶液-甲醇溶液（体积比=90∶10）、β-葡萄糖醛酸酶（30U·mL-1）。
对照品：莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇（含量均≥98%）。同位素内标：莱克多巴胺-d3、克伦特罗-d9、沙丁胺醇-d3。
1.1.3主要仪器设备
TSQQuantis型号高效液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）；分析天平；氮吹仪；水平振荡器；固相萃取装置等[1]。
1.2混合对照品溶液及内标液的制备
准确称取莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇各10mg,放置于100mL的棕色量瓶内，用甲醇定容，将其制备为0.1mg·mL-1的混合对照品溶液，4℃避光保存备用，临用时可用甲醇稀释为所需浓度混合液。称取3种同位素内标10mg，同样的方法配置为100μg·mL-1的储备液保存，用时可用甲酸水溶液稀释为100μg·L-1的混合液，获得内标工作液[2]。
1.3样品前处理
1.3.1酶解和提取
称取新鲜或者冷藏解冻的试料2g置于50mL离心管内，加入0.2mol·L-1的乙酸铵缓冲液6mL、β-葡萄糖醛酸酶40μl，涡旋均匀，于避光条件下37℃水浴振荡16h，放至室温备用。
1.3.2萃取、净化、浓缩
取上步骤获得备用液，加入100ng·mL-1的内标液100μL,涡旋均匀并在8000r·min-1的条件下离心8min，取上清液，加入5mL高氯酸溶液（0.1mol·L-1）,涡旋均匀，用高氯酸调节pH至1，在8000r·min-1的条件下离心8min，在获得的上清液中加入NaOH溶液（10mol·L-1）,调节pH至10。加入乙酸乙酯15mL，中速振荡5min，在5000r·min-1的条件下离心5min，获取上层有机相。对于上层水相，可加入叔丁基甲醚10mL进行提取，将前后2次提取的有机相进行合并，50℃氮吹，并用甲酸溶液（2%）溶解备用[3]。
应用混合型阳离子交换固相萃取柱进行净化，分别用3mL甲醇及3%甲酸活化萃取柱后，备用液过柱后用2%甲酸与甲醇各3mL淋洗、抽干，用5%的氨化甲醇溶液3mL洗脱后50℃氮吹。
用0.5mL甲醇-1%甲酸溶液溶解残余物后过滤膜（0.22μm孔径），获得供试品溶液。
1.4仪器条件
色谱柱：WatersC18(XbridgeBEH2.5μm)；柱温：40℃；进样量：20μL；流速：0.2mL·min-1；流动相：溶剂A+溶剂B。梯度洗脱程序见表1。
表1流动相及梯度洗脱程序表
离子源：电喷雾（ESI+）；扫描方式：选择反应检测扫描（SRM）；离子喷雾电压：3500V；离子传输管温度：320℃；蒸汽温度：350℃；鞘气流速：40Arb；辅助气流速：5Arb。
2结果与分析
2.1酶解温度的优化
通过查阅相关文献得知，β-葡萄糖醛酸酶适用的温度处于40～110℃，于试料牛肉离心管内，加入0.2mol·L-1的乙酸铵缓冲液6mL、β-葡萄糖醛酸酶40μL,涡旋均匀后分别于避光条件下37、45、53、61、69℃水浴振荡16h，再经萃取、净化、浓缩后对3种β-受体激动剂含量进行检测，结果见表2。
表2不同酶解温度对β-受体激动剂测定结果的影响表
表2显示,当酶解温度在37～45℃范围内时，3种β-受体激动剂的测定结果差距不明显,均与推荐值最接近，随着温度的继续升高，在达到53℃后，测定值会有所降低，这可能因为温度过高会导致物质挥发丢失。所以，最合适的酶解温度为37℃[4-5]。
2.2酶解时间的优化
设置样品酶解与提取前处理的酶解时间为37℃下水浴振荡8、12、16、20、24h，再经萃取、净化、浓缩后对3种β-受体激动剂含量检测，结果见表3。
表3不同酶解时间对β-受体激动剂测定结果的影响表
表3显示，酶解时间为8、12、16h时，β-受体激动剂含量测定值差距相对较小，均接近推荐值5μg·kg-1，适合酶解时间为8h。
2.3净化条件的优化
应用SPE技术净化，分别创建4种淋洗液与洗脱程序，研究加标回收率，选择最佳净化条件，具体见表4。
表4不同净化条件的β-激动剂回收率表
表4显示，方法1与方法2下3种β-激动剂的平均回收率差异性不大，分别为98.5%、98.4%。因此，该实验净化条件可以选择方法1或者方法2。
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