ICS11.220
CCSB41
团 体 标 准
T/CVMA202—2024
副猪格拉菌抗体微量凝集试验操作规程
ProceduresfortheoperationofmicroagglutinationtestforantibodyagainstHaemophilusparasuis
2024-12-4发布 2024-12-4实施
中国兽医协会 发布
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T/CVMA202—2024
前 言
本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由青岛市动物疫病预防控制中心提出。
本文件由中国兽医协会归口。
本文件主要起草单位：青岛市动物疫病预防控制中心、青岛农业大学、青岛博霖生物科技有限公司、青岛市黄岛区动物疫病预防与控制中心。
本文件主要起草人：李彦、赵永达、郭莉莉、段笑笑、杨胜男、邴啟政、马帅、尹斐斐、田丽华、高斌、厉博雅、王守杰、柳妍玲、陈佳文。
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T/CVMA202—2024
副猪格拉菌抗体微量凝集试验操作规程
范围
本文件规定了副猪格拉菌微量凝集抗体检测的操作规程。
本文件适用于副猪格拉菌的抗体水平检测、疫病诊断及监测。
规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB19489 实验室生物安全通用要求
GB/T27401 实验室质量控制规范动物检疫
NY/T541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CFU：菌落形成单位（Colony-FormingUnits）HPS：副猪格拉菌（Haemophilusparasuis）
MAT：微量凝集抗体检测试验（micro-agglutinationtest）PBS：磷酸缓冲盐溶液（phosphatebelancedsolution）SPF：无特定病原体动物（SpecificPathogenFree）
试剂与材料
阳性血清：由副猪格拉菌血清4型、5型和13型标准菌株制备的疫苗免疫SPF兔后制备的高免血清。
阴性血清：采集SPF兔血液制备的血清。
菌株：副猪格拉菌血清4型、5型和13型标准菌株，冻干型。
T/CVMA202—2024
仪器设备
紫外分光光度计：190~1100nm。
6.2 恒温恒湿培养箱：0℃~65℃、±1.0℃；不均匀度≤±1℃。
分析天平：精度为0.001g。
离心机：转速不低于13,000r/min。
6.5 冰箱：2℃~8℃和-20℃以下。
酸度计。
电热恒温水槽：室温至100℃，温度精度±0.5℃。
涡旋振荡器。
微量移液器（量程：0.5μL~10μL、2μL~20μL、20μL~200μL和200μL~1000μL）。
无菌离心管（规格：1.5mL、10mL、50mL）。
实验步骤
通则
应符合GB19489和NY/T541中关于实验室生物安全和兽医诊断样品的采集、保存与运输的要求。
血液样品采集与处理
静脉无菌采血。采集后的血液室温静置不少于2h，待自然凝固后，4000r/min离心10min，吸出上层血清待检。
样品保存和运输
样品采集后应冷链运输，并于24h内送达实验室。在2℃~8℃条件下保存不应超过24h，如超过24h需冷冻保存。如无法冷链运输，应将样品置于含10%甘油的平衡盐溶液（配制方法按照附录A中A.1）中运输。
抗原制备
菌株复苏 取副猪格拉菌血清4型、5型和13型标准冻干菌株，加入2.0mL灭菌生理盐水溶解，分别划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂TSA培养基（含5%无菌牛血清和0.01%NAD）（配制方法按照附录A中A.2），于恒温培养箱中5%CO2、37℃培养48h。
菌液扩繁分别挑取多个典型菌落密集划线接种于TSA培养基，置于5%CO2、37℃恒温培养箱中培养12h~16h后，用灭菌生理盐水分别洗下菌苔，用紫外分光光度计测定OD600，并进行活菌计数，用灭菌生理盐水适量稀释，使各菌株的活菌量约为3.0×l09C