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ELISA实验经验梳理与总结
ELISA
前置知识：
ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，主要用于检测和定量分析样品中的特定抗原或抗体。它基于免疫学原理，具有
高灵敏度和高特异性。
ELISA实验一般包含以下步骤：
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涂覆：把待检测的抗原或抗体溶液加入微孔板（通常为96孔板），使其在孔板表面形成固定的抗原或抗体层。
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阻断：涂覆后，加入阻断剂如牛血清蛋白（BSA）或牛奶粉，覆盖孔板上未被固定的表面，以减少非特异性结合，降低背景信号。
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样品加入：将待测样品加到微孔板中，让样品中的目标抗原或抗体与固定在孔板上的抗体或抗原相互作用。
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洗涤：反复洗涤孔板，去除未结合的物质，从而减少背景信号。
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探针加入：加入与待测物特异性结合的酶标记二抗（如辣根过氧化物酶-HRP）或酶标记抗原，使其与样品中的目标物结合。
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洗涤：再次洗涤孔板，去除未结合的酶标记物。
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底物加入：加入一种底物，该底物能与酶标记物相互作用，产生可测量的信号。常用的底物是可被酶催化产生颜色或荧光的物质。
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反应停止：加入停止剂，停止底物的反应，防止信号进一步增加。
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信号测量：使用光谱仪或荧光测量仪测量底物反应产生的信号，依据信号强度确定样品中目标物的浓度。
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问题：ELISA空白背景高的常见原因及处理方法
一般情况下，阴性孔吸光光度值不应超过0.1。
常见原因如下：
1）洗板不彻底
解决方法：
①进行充分洗涤，若洗板时间不足会导致抗体残留使阴性对照显色，可尝试延长洗板时间、增加洗板频率，并在洗液中加入表面活
性剂Tween-20。洗板时要确保每一步都完全洗涤，充分拍板至孔内无明显残留液体。
②避免交叉污染，弃去洗液和孵育抗体时防止交叉污染，移液枪头尽量一次性使用，拍板的滤纸不可反复使用。
2）显色液变质或试剂过期
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解决方法：检查试剂盒有效期，或使用新的试剂盒并按说明书要求保存。每次剩余的显色液最好不回收，或只回收用洗净容器装的
显色液。
3）试剂稀释错误，检测抗体/酶结合物工作液浓度过高
解决方法：按照说明书推荐的稀释倍数稀释抗体。
4）试剂盒组分未平衡
解决方法：试剂盒各组分需平衡至室温后再进行实验。
5）混用其他试剂盒试剂
解决方法：确保使用试剂盒内完整的一套试剂进行实验，不同品牌及不同批次的试剂可能不匹配，不同批号试剂不要混用。
6）蒸馏水受酶等污染
解决方法：使用新鲜蒸馏水。
7）培养箱温度超过37℃或反应时间过长
解决方法：孵育时间过长、温度过高可能致使非特异性结合增加，造成本底增高。检查恒温箱，确保孵育温度稳定在37℃，按照说
明书的反应时间进行孵育。
8）酶标板底部有污渍
解决方法：加完终止液后、检测前，用75%乙醇浸润的脱脂棉球擦拭酶标板底部，确认无污渍后再检