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mTOR介导小豆蔻明抑制IR大鼠胸主动脉

平滑肌细胞增殖的研究

廖琴

摘要

研究背景及目的

胰岛素抵抗(insulinresistence,IR)状态下，体内胰岛素(insulin,Ins)水平相对升高，促进血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells,VSMCs)过度增生，导致血管增殖性病变。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin,mTOR)为胰岛素信号通路中的重要蛋白，其表达或功能的改变是引起VSMCs增殖的主要原因。雷帕霉素(rapamycin,RAP)是mTOR的特异性抑制剂，具有较强地抑制免疫及抑制VSMCs增殖的作用，因不良反应多，仅用于器官移植抗排异反应和冠脉成形术支架涂层。目前作用于mTOR靶标防治血管增殖性病变的上市药物很少。黄酮类化合物小豆蔻明(Cardamonin,CAR)具有舒张血管、抑制血小板聚集等多种血管保护作用。我室近期实验表明CAR可抑制高糖高Ins培养状态下VSMCs增殖，机制可能与Ins信号通路中mTOR相关。CAR在整体动物中是否产生类似的作用，且通过mTOR介导，有待深入研究。

本课题利用高果糖饮食复制伴血管增生性病变的IR大鼠模型，观察CAR对大鼠IR及大血管病变的作用，同时考察大鼠血管组织mTOR及其下游分子mRNA及蛋白表达量的变化，探讨CAR作用的可能靶标及机制。

方法

SD大鼠适应性喂养1w后随机分为空白对照组(CG)和高果糖组(FrcG),分别给予普通饲料和60%高果糖饲料，连续4w,复制IR模型。眼眶静脉丛穿刺取血，已糖激酶法测空腹血糖(FBG)、放免法测空腹血清胰岛素(FINS),计算HOMA模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)及胰岛素敏感指数(ISI),HOMA-IR大于空白对照组均数加1个标准差且ISI小于正常组均数减1个标准差者视为IR造模成功。IR大鼠继续给予高果糖饲料，每2w各组随机杀检2只，光镜及电镜下观察胸主动脉中膜层弹力纤维、细胞排列以及VSMCs超微结构，若中膜层增厚，VSMCs内异染色质增多，细胞器丰富，视为伴血管增生性病变IR大鼠模型复制成功。再将高果糖组大鼠按体重随机分为高果糖模型组(FMG)、溶剂组(SG)、RAP组(RAPG,0.8mg-kg1)、CAR高剂量组(HCARG,7.5mg·kg)、CAR中剂量组(MCARG,5mgkg)、CAR低剂量组(LCARG,2.5mg-kg1),

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每组各8只。CG、FMG给予等量生理盐水；SG按体重给予等浓度的溶媒；RAPG、HCARG、MCARG、LCARG给予相应药物，剂量根据文献报道及预试验结果选定，给药途径为腹腔注射，每日1次，维持4w。

给药结束，分别测定血清FBG、FINS、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、尿素、肌酐、丙氨酸转氨酶、谷草转氨酶及全血凝血时间(TBC),计算HOMA-IR、ISI、大鼠胸主动脉中膜层与管腔面积比(MA/LA),采用免疫组织化学法测定mTOR、p-P70S6K1蛋白表达，荧光实时定量RT-PCR法测定mTOR、P70S6K1、4E-BP1mRNA表达量。

整个实验过程，每周测量大鼠体重(BW)、每日进食量及饮水量。

结果

1.造模起始至8w,FrcG大鼠BW、每日进食量及饮水量与CG组无显著差异。给药4w后，各组大鼠BW、每日进食量及饮水量组间亦无明显差异。

2.造模4w,FrecG大鼠FBG、FINS、HOMA-IR较CG组明显升高(8.09±1.14vs6.52±0.95mmol/L,P0.01;32.2±9.2vs21.7±7.7mlU/L,P0.01;11.06±2.70vs5.35±

0.98,P0.01)、ISI较CG组明显下降(-5.49±0.37vs-4.87±0.38,P0.01),说明IR模型复制成功。继续造模至8w,Frc组FBG、FINS、HOMA-IR、ISI与CG组比较的趋势和显著性差异与4w时相似，FINS较4w显著增加(36.8±9.5vs32.2±9.2,mIU/L,P0.01),说明造模时间延长，Frc组高胰岛素血症加重；8w镜检，Frc组大鼠胸主动脉中膜层增厚，弹力纤维及VSMCs排列不规则，且平滑肌细胞肿大变性，胞浆内有空泡形成，胞核