第四节细胞实验技术;一、细胞计数及活力测定方法;;细胞密度〔个/ml〕＝〔4个大格细胞总数/4〕×104〔10的4次方〕;细胞计数板获得的细胞数目的结果是大概的值，要想绝对计数需要使用流式细胞仪。;
原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，别离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计〔flowcytometer〕。
;;二、培养细胞生长曲线的绘制
和分裂指数的测定;二、培养细胞生长曲线的绘制
和分裂指数的测定;;二、培养细胞生长曲线的绘制
和分裂指数的测定;分裂指数的测定方法;;三、细胞核型分析;三、细胞核型分析;核型模式图;四、细胞周期的测定;;操作步骤：
1、细胞生长至指数期时，向培养液中参加BrdU，使最终浓度为10μg/ml。
2、44小时加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。
3、48小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。
4、常规染色体制片
5、染色体玻片置56℃水浴锅盖上，铺上2×SSC液，距紫外灯管6cm处紫外照射30分钟。
6、弃去2×SSC液，流水冲洗。
7、Giemsa液染色10分钟，流水冲洗，晾干。
8、镜检100个分裂相，计第一、二、三、四细胞期分裂指数。
9、计算：
细胞周期〔Tc〕=48/{〔M1+2M2+3M3+4M4〕/100}〔小时〕;五、免疫组织化学技术;;免疫荧光法可分为以下三种;;;;胚胎干细胞;Oct-4staining;;免疫荧光根本实验步骤：
〔1〕细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，
〔2〕固定。通常用多聚甲醛固定细胞。固定的目的除去防碍抗原-抗体结合的类脂，多聚甲醛通常通过自由氨基酸基团形成分子间桥连，从而产生一种相互连接的网络结构。交联剂比有机溶剂更易于保持细胞的结构。
〔3〕通透。通透通常选用TritonX－100。通透剂一般都是去垢剂，它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。，通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5min.
〔4〕封闭。封闭的目的是为了减少抗体的非特异性结合，通常使用BSA
〔5〕一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。
〔6〕二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育
〔7〕封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。;常用的荧光素;免疫荧光法优缺点;核染色;DAPI染色的细胞核;Hochst染色的细胞;用抗α-tubulin抗体染色显示微管(绿色);细胞核:红色,PI染色
(激光共聚焦显微镜照片)生物论坛,;六、细胞器的别离;;速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀;在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。;;A等速度沉降，B等密度沉降;密度梯度离心
等速度沉降〔velocitysedimentation〕主要用于别离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种沉降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被别离生物颗粒的最小密度。生物颗粒〔细胞或细胞器〕在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而到达别离。
等密度沉降〔isopycnicsedimentation〕适用于别离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间那么沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里到达平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器别离。介质的最高密度应大于被别离组分的最大密度，而且介质的梯度要求较高的陡度，不能太平缓。这种方法适于别离细胞器，而不太适于别离和纯化细胞。;;细胞核和线粒体的分级别离;;七、细胞融合;;融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解;聚乙二醇〔PEG〕法细胞融合步骤
〔1〕将两种不同亲本细胞各5×l06混匀；
〔2〕离心沉淀，吸去上清液；
〔3〕加1ml50％PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟；
〔4〕加9ml培养液，离心沉淀，吸去上清液；洗去PEG
〔5〕加5ml培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养
液至5ml，37℃的CO2培养箱中培养。
〔6〕6—24小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。;;细胞融合的电融合法;电融合的根本过程：
细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质