细胞悬液与台盼蓝染色液混匀后，应在5min内计数完毕，时间过长，由于细胞活度下降而通透性增加，从而影响拒染细胞数，因而影响实验的真实结果。
细胞排染试验注意事项第30页，共78页，星期日，2025年，2月5日
在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中随着培养时间延长呈指数生长，以培养时间为横坐标，细胞数的对数为纵坐标作图，可得一条直线，故称此时为对数生长期。随着细胞密度不断增高，由于代谢产物的积聚及营养物的消耗，细胞生长逐渐减慢以致停止，此时称高坪期或稳定期。药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反映出来。实验原理肿瘤细胞的活性检测
▲肿瘤细胞生长曲线第31页，共78页，星期日，2025年，2月5日选取对数生长期的肿瘤细胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培养基配成细胞浓度为1×104/ml的细胞悬液分装在培养瓶中，实验组加入不同浓度的被测样品，对照组加入等体积的溶剂。细胞置含37℃、5%CO2的孵箱中培养，在培养后ld、2d、3d、4d、5d、7d各取样，置血细胞计数板中计数，以每毫升细胞数的对数为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线（计数法）。
注意：悬浮细胞同一培养物可连续取样，而贴壁细胞每个培养瓶只能作一次计数，故要计算好需要的细胞瓶数。实验方法肿瘤细胞的活性检测
▲肿瘤细胞生长曲线第32页，共78页，星期日，2025年，2月5日药物对细胞的杀伤率＝×100%也可用MTT法测定细胞生长曲线N0:对照组生长曲线线性部分外推至y轴的截距，代表接种后对照组具有增殖力的细胞数；N0′:实验组生长曲线线性部分外推至y轴的截距，代表接种后实验组具有增殖力的细胞数。第33页，共78页，星期日，2025年，2月5日MTT比色法：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT（噻唑蓝,Thiazolyl?blue）还原为蓝紫色结晶，并沉淀在细胞里，而死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原。DMSO能够溶解细胞中的蓝紫色结晶甲臜(formazan)，用酶标仪在570nm波长处测定其吸光度值(OD值)，OD值的大小可间接反映活细胞的数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物的形成量与活细胞数成正比。由吸光度值，根据相关公式计算抑制率。
MTT实验实验原理第34页，共78页，星期日，2025年，2月5日实验方法1.将对数生长期的肿瘤细胞用胰蛋白酶消化后，用含10％小牛血清的培养基配成浓度约为5000个细胞/ml的细胞悬液。2.接种在96孔培养板中，每孔接种200μl。3.经37℃、5%CO2的温箱中培养24h。4.实验组加入含不同浓度药物的培养液，对照组则用等体积的培养液，每组设3个以上的平行孔，37℃、5%CO2，培养所设定的时间。
MTT实验第35页，共78页，星期日，2025年，2月5日实验方法5.弃去上清液，用培养液洗3次，以去除药液。然后，每孔加入200μl含0.2mg/mlMTT的无血清培养基，在37℃培养4h。6.小心弃去上清，并加入200μl酸化异丙醇（或DMSO）溶解MTT甲臜沉淀，用振荡器混匀后，在酶标仪上用波长为570nm，参比波为450nm测定光密度(OD)值。
MTT实验第36页，共78页，星期日，2025年，2月5日按公式计算IC50举例：各组药物浓度：0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001（稀释倍数为10，最大浓度为0.1）抑制率分别为：0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。将上述数据代入下列计算公式：lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:最大剂量的对数=lg0.1=-1I:（最大剂量/相邻剂量)的对数=lg0.1/0.01=lg10=1P:阳性反应率之和=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Pm:最大阳性反应率=0.95，Pn:最小阳性反应率=0.06lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=0.00025第37页，共78页，星期日，2025年，2月5日肿瘤细胞体外实验是进行抗癌药物筛选检测、研究癌变机理以及恶性肿瘤分子生物学研究的重要手段。主要优点如下：1.不需要