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DB36
FORMTEXT江西省地方标准
DB36/FORMTEXT—FORMTEXT
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黑斑侧褶蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴定技术规范
TechnicalSpecificationforisolationandIdentificationofElizabethkingiamiricolainrananigromaculata
FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX发布
FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX实施
江西省市场监督管理局发布
DBXX/XXXXX—XXXX
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目次
TOC\h\z\t前言、引言标题,1,参考文献、索引标题,1,章标题,1,参考文献,1,附录标识,1前言 II
1范围 1
2规范性引用文件 1
3术语和定义 1
4设备和材料 1
5培养基和试剂 2
6分离与鉴定程序 3
7操作步骤 4
8菌种保存及生物安全 5
附录 6
前言
本文件按照GB/T1.1-2020给出的规则起草。
本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
本文件由江西省农业农村厅提出并归口。
本文件起草单位：江西省农业科学院畜牧兽医研究所、南昌大学、江西省农业技术推广中心。
本文件主要起草人：刘文舒、王玉柱、郭小泽、李思明、简少卿、李小勇、陈彦良、唐艳强、肖海红。
黑斑侧褶黑斑蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴定技术规范
范围
本文件规定了黑斑侧褶蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴定技术规范。
本文件适用于黑斑侧褶蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴。
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T19489实验室生物安全通用要求
《动物病原微生物菌（毒）种保藏管理办法》
《中国微生物菌种保藏管理条例》
术语与定义
毁髓法pithing
毁髓针刺入蛙枕骨大孔后，将针后端压平,水平向前进入蛙颅腔,左右摆动，捣毁双侧脑组织脑脊髓。
PCRPolymeraseChainReaction
PCR是在体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，是由于高温变性、低温退火等反应组成1个周期，循环进行，使目的DNA得以快速进行扩增。
设备和材料
除微生物实验室常规灭菌与培养设备外，其他设备和材料如下：
无菌采样袋或商品化采样棉拭子、剪刀
一次性接种环
无菌培养皿：90mm
微量加样器：1μL，2.5μL，10μL，100μL和1000μL
Tip头（与微量加样器相匹配）
1.5ml无菌离心管
有冷藏（4℃）和冷冻（－20℃）功能的冰箱
恒温培养箱
手持式均质器：适用于1.5mL离心管
电子天平：最小刻度0.01g
显微镜（1000倍）
高速冷冻离心机（≥12000r/min）
恒温水浴锅
PCR仪
电泳仪
自动凝胶成像系统
涡旋仪
微波炉
无菌工作台
培养基和试剂
除特殊说明，所有实验用水应符合GB/T6682规定的三级水
营养肉汤（附录）
非选择性细菌培养基（附录）
DNAMarker：1Kb
扩增片段长度及引物
16SrDNA扩增片段长度：约1500bp
上游引物序列：27f5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′
下游引物序列：1492r5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′
gyrB扩增片段长度：约1200bp
上游引物序列：gyrB3F5′-TCCGGCGGTCTGCACGGCGT-3′
下游引物序列：gyrB14R5′-TTGTCCGGGTTGTACTCGTC-3′
灭菌生理盐水:0.6%
10×PCR缓冲液
Taq聚合酶（0.5U/μL）
dNTPs（2mmol）
1.2%琼脂糖凝胶（附录）
50×TAE缓冲溶液（附录）
1×TAE缓冲溶液（电泳缓冲液）（附录）
核酸染料：GelRed
分离与鉴定技术流程
米尔伊丽莎白菌的确定形态学鉴定挑取疑似单菌落纯化培养好的菌悬浊液摇晃均匀，在无菌状态下划线接种于无菌培养基中，恒温培养箱（36℃±1℃）培养24h组织液与营养肉汤按照1:10比例进行混合，恒温培养箱（36
米尔伊丽莎白菌的确定
形态学鉴定
挑取疑似单菌落纯化
培养好的菌悬浊液摇晃均匀，在无菌状态下划线接种于